一、前言：

1、             現(xiàn)狀

目前獸醫(yī)用藥幾乎占據(jù)了所有抗微生物yw的50%，因此食品病原菌、條件致病菌和共生菌不可避免的成了耐藥菌。在過(guò)去的50年中大約有100萬(wàn)噸的kss被釋放到生物圈中。歐洲動(dòng)物衛(wèi)生聯(lián)盟（European Federation of Animal Health ，FEDESA）對(duì)歐盟和瑞士kss使用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，僅1997年用于人類(lèi)健康的kss達(dá)5460噸，用于動(dòng)物健康的kss達(dá)3465噸，用于動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的kss達(dá)1575噸，并有逐年增加的趨勢(shì)。

在我國(guó)，由于獸醫(yī)用藥制度的不完善及一些養(yǎng)殖廠受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使及相應(yīng)的檢測(cè)監(jiān)督體系不健全，yw的濫用現(xiàn)象更為嚴(yán)重，動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥的污染時(shí)有發(fā)生。其潛在的致癌、致畸作用引起了社會(huì)的普遍關(guān)注，由于水產(chǎn)品中氯霉素含量過(guò)高，歐盟委員會(huì)于今年1月作出禁止中國(guó)動(dòng)物源食品進(jìn)口的協(xié)議，使得我國(guó)水產(chǎn)品對(duì)歐盟出口嚴(yán)重受挫，雖然現(xiàn)在部分產(chǎn)品開(kāi)始解禁，但形式依然不容樂(lè)觀；美國(guó)、日本等國(guó)也開(kāi)始高度關(guān)注我國(guó)水產(chǎn)品的質(zhì)量，并出臺(tái)一系列相關(guān)政策，對(duì)我國(guó)出口動(dòng)物性產(chǎn)品進(jìn)行限制。在現(xiàn)代文明的世界，健康{dy}的貿(mào)易法則將是關(guān)稅、價(jià)格、質(zhì)量所不可比擬的，政治上的友好往來(lái)無(wú)法替代經(jīng)濟(jì)貿(mào)易中的游戲規(guī)則。

2、食品中獸藥殘留對(duì)人類(lèi)的危害

2.1耐藥菌株的產(chǎn)生

kss使用和xj耐藥性永遠(yuǎn)是互相依存、互相制約的矛盾的兩個(gè)方面，xj耐藥非正常增加，往往是kss的非正常使用的結(jié)果。早在1920-30年青霉素問(wèn)世時(shí)，Dr Fleming就提出了青霉素的耐藥性問(wèn)題。隨著時(shí)代的發(fā)展和各種新藥的出現(xiàn)，耐藥性菌株也接踵而至（即包括yw選擇壓力的結(jié)果也包括xj自身的進(jìn)化）。kss的副作用以及耐藥菌株的存在將嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，而且臨床亞zl水平的kss更容易促使抗性基因的轉(zhuǎn)移，比如對(duì)動(dòng)物進(jìn)行低水平四環(huán)素zl，其糞腸菌群由對(duì)四環(huán)素敏感逐漸變成抗四環(huán)素{zh1}發(fā)展成對(duì)其它yw也產(chǎn)生抗性。在長(zhǎng)期的生活中，恰恰是人類(lèi)和動(dòng)物腸道的正常菌群成了耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)，并不斷的將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病菌，并在人和動(dòng)物中交叉?zhèn)鞑ィ绕涫轻尫诺江h(huán)境中耐藥菌的危害更為嚴(yán)重，可造成耐藥基因的迅速轉(zhuǎn)移。

2.2kss的毒副作用

殘留在動(dòng)物性食品中的kss被人們食用后，除了加速人體內(nèi)耐藥菌株的進(jìn)化之外，kss本身的毒副作用往往威脅人類(lèi)尤其是孕婦和嬰兒的健康，這一點(diǎn)在過(guò)去往往很容易被忽視。

2.2.1氯霉素

主要由Streptomyces venezuelae產(chǎn)生，目前已能人工合成。它能抑制xj蛋白質(zhì)生物合成，其效應(yīng)部位位于核糖體上，因而對(duì)大多數(shù)G+菌和G－菌都有殺傷力。氯霉素的毒副作用較多，其常見(jiàn)的是再生障礙貧血、造血功能紊亂、灰嬰綜合征、肢體感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)障礙及休克。雖然氯霉素在動(dòng)物疾病防治上曾發(fā)揮過(guò)一定的作用，但由于氯霉素可以產(chǎn)生致命性的副作用，因此歐盟已經(jīng)在畜牧、水產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中禁止使用。

2.2.2b－內(nèi)酰胺

b－內(nèi)酰胺類(lèi)kss通過(guò)抑制xj轉(zhuǎn)肽酶的活性而干擾細(xì)胞壁肽聚糖的合成，安芐青霉素和青霉素G是該類(lèi)最常見(jiàn)的兩種化合物，由Penicillium chrysogenum產(chǎn)生。它可以通過(guò)胎盤(pán)傳給胎兒，也能通過(guò)乳腺進(jìn)入乳中。最常見(jiàn)的副作用是以皮膚出現(xiàn)紅斑為主要癥狀的過(guò)敏反應(yīng)以及胃腸道紊亂引起的腹瀉、惡心和嘔吐。

2.2.3四環(huán)素

包括Oxytetracycline （土霉素，OTC）、tetracycline （四環(huán)素，TC）、 chlortetracycline （金霉素，CTC） 和doxycycline （強(qiáng)力霉素，DC）等。

2.2.4  b－興奮劑

        為擬交感神經(jīng)類(lèi)yw，該類(lèi)興奮劑的受體為b2受體故得名。該類(lèi)興奮劑可以促使肌肉骨骼肌血管壁擴(kuò)張、支氣管和子宮平滑肌松弛。因而在獸醫(yī)臨床上b2興奮劑被廣泛用作支氣管擴(kuò)張藥和子宮松弛藥，同時(shí)也被非法用作動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)再分配的促生長(zhǎng)劑。副作用，如：焦躁、震顫、過(guò)敏、神智不清、食欲不振、惡心和嘔吐等以及心悸、高血壓、心律失常、心動(dòng)過(guò)速等心血管癥狀，其中擬交感神經(jīng)類(lèi)物質(zhì)在組織中的溢出均可導(dǎo)致組織壞死。

2.2.5雌js

是一種人工合成的非固醇類(lèi)雌js，主要用于zl婦科紊亂、乳房和前列腺惡性腫瘤，為一種致癌物質(zhì)；在肝臟中代謝緩慢，最終能隨尿和糞便排出。副作用包括：水腫、引起性欲沖動(dòng)、改變?cè)陆?jīng)周期、乳房異常發(fā)育、肝功能改變、胃腸道紊亂、衰竭、tt、皮膚紅斑、風(fēng)疹。對(duì)于雄性動(dòng)物來(lái)說(shuō)，大劑量的雌js可以增加血管栓塞的危險(xiǎn)。此外，雌js還能引起子宮內(nèi)膜增生，使患子宮癌的頻率增加。大劑量使用雌js還可以導(dǎo)致骨骼發(fā)育閉合，停止生長(zhǎng)。也能促使生殖道變形，對(duì)于雄性動(dòng)物能使精子變形以及嘔吐等。

2.2.6氨基甙類(lèi)kss

主要包括慶大霉素、鏈霉素、新霉素、卡那霉素等，為以氨基環(huán)醇和氨基糖相連成核糖單位的多價(jià)陽(yáng)離子復(fù)合物。氨基甙類(lèi)通過(guò)與xj核糖體不可逆結(jié)合而干擾xj蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜塌陷。氨基甙類(lèi)yw的主要副作用是對(duì)聽(tīng)覺(jué)器官和腎的毒性、過(guò)敏反應(yīng)以及對(duì)神經(jīng)肌肉的影響。其中，慶大霉素能引起肝功紊亂、外周和zssj炎（包括腦炎、呆滯、抽搐）；鏈霉素能導(dǎo)致神經(jīng)紊亂，包括視覺(jué)神經(jīng)炎和外周神經(jīng)炎，以及嚴(yán)重的皮炎、過(guò)敏等超敏感反應(yīng)。

二、獸藥殘留的快速檢測(cè)方法

目前國(guó)際上對(duì)kss和js類(lèi)yw殘留的檢測(cè)主要有儀器分析法（包括HPLC和GC-MS）和生物學(xué)快速檢測(cè)法（如：ELISA、RIA、CharmⅡ等）。其中，儀器分析法既要求儀器設(shè)備具有相當(dāng)高的精度，也要求技術(shù)人員具有一定的操作和分析技能。作為儀器分析法，其昂貴的價(jià)格和軟件更新的緩慢以及操作上的煩瑣限制了此法的推廣；但由于檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到ng水平，在一些國(guó)家大型實(shí)驗(yàn)室里仍作為檢驗(yàn)的參考依據(jù)使用。而生物學(xué)快速檢測(cè)法由于其操作上的簡(jiǎn)便、快速以及達(dá)到ng水平的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，以成為動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)的一種重要手段。尤其是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）和CharmⅡ，其操作上的簡(jiǎn)便、快速和強(qiáng)烈的信噪比、達(dá)到ng水平的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，其缺陷在于該法會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，但做為一種快速篩選方法備受技術(shù)人員的青睞，在檢測(cè)部門(mén)有著廣泛的應(yīng)用前景。

  不同的ELISA原理直接影響其檢測(cè)下限、特異性及結(jié)果的計(jì)算。

樣品的前處理

不同樣品有其特定的前處理方法，主要有以下幾種：

有機(jī)物抽提法：（氯霉素）

利用yw在有機(jī)物中的溶解性，達(dá)到分離純化的目的

樣品均質(zhì)         稱(chēng)量      乙晴和或乙酸乙酯抽提       離心      吹干

      異辛烷/氯仿或正己烷抽提     離心      取水相分析

離子交換法（如：C18過(guò)柱法）（鏈霉素）

離子交換是利用一些帶離子基團(tuán)的物質(zhì)，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)按所帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。

樣品稱(chēng)量      溶解     上柱

C18柱平衡                 洗柱      吸柱干燥     洗提      吹干

緩沖液重懸      分析

（免疫）親和層析（雌js）

   利用生物大分子的生物學(xué)特性而設(shè)計(jì)的層析分離技術(shù)，如利用抗原和抗體、酶和酶的抑制物或配體、js和受體等之間的親和力，在一定條件下，兩者可緊密結(jié)合形成復(fù)合物，若將其中一者固定在載體上，則可從溶液中提取和分離相應(yīng)的另一方，并達(dá)到很高的純度?，F(xiàn)有商品化生產(chǎn)，（方便，減少裝柱等繁瑣步驟）其操作步驟與上者相似，可以按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。

 檢測(cè)原理

   微生物受體免疫分析法，屬于免疫分析法的一種，其建立的基礎(chǔ)是yw功能團(tuán)與微生物受體位點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)。在某些方面類(lèi)似于放射免疫分析（RIA），所不同的是RIA使用抗體作為結(jié)合劑，而受體分析則是使用xj細(xì)胞的固定位點(diǎn)當(dāng)做特殊的結(jié)合劑。

    一個(gè)單一的xj細(xì)胞含有可結(jié)合yw的特殊結(jié)合位點(diǎn)，yw和受體位點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)離解常數(shù)低，因而具特異性和靈敏性。對(duì)于該法具體原理Charm公司未有詳細(xì)深入的報(bào)道（商業(yè)方面考慮），主要是利用兩種不同的xj提供7大類(lèi)kss結(jié)合的必須位點(diǎn)，yw的功能團(tuán)與位點(diǎn)有關(guān)，不象免疫分析只涉及到側(cè)鏈，一種微生物受體可結(jié)合一類(lèi)yw的所有yw。

象ELISA類(lèi)似，這種結(jié)合也是一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。在試管中加入一定量的xj（受體）、放射性標(biāo)記yw和樣品，樣品中的yw和放射性標(biāo)記yw競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體，未于受體位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記性yw在讀數(shù)前被去掉，加入閃爍液，在分析儀上讀數(shù)。

檢測(cè)的一般程序

準(zhǔn)備工作：首先按說(shuō)明書(shū)配制好所需的提取緩沖液、M2緩沖液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

儀器零點(diǎn)測(cè)定：用空試管測(cè)定儀器的零點(diǎn)是否正常。

試劑和儀器有效性確認(rèn)：檢測(cè)陰性對(duì)照液和陽(yáng)性對(duì)照液各3次，求出cpm值的平均值，與出廠的計(jì)數(shù)單對(duì)比，{zh0}能在其±10%左右波動(dòng)。如果與計(jì)數(shù)單相比偏移較大，試劑可能部分失效，但只要陽(yáng)性平均值/陰性平均值小于0.7，試劑仍然可用，但靈敏度會(huì)有所降低。

控制點(diǎn)的確定：控制點(diǎn)是陰性結(jié)果與陽(yáng)性結(jié)果的臨界值。利用控制點(diǎn)來(lái)判斷結(jié)果。有兩種確定控制點(diǎn)的方法：根據(jù)樣品的種類(lèi)或檢測(cè)水平選擇適當(dāng)?shù)目刂泣c(diǎn)確定方法?？刂泣c(diǎn)確定方法有二。有些說(shuō)明書(shū)上兩種方法都列出，用戶(hù)可根據(jù)需要選擇，{zh0}選第二種。

方法一：直接以陰性對(duì)照來(lái)確定控制點(diǎn)，一般樣品干擾小或接近儀器的下限時(shí)，采用這種方法，只需再做3次，與前3次試劑性能確認(rèn)的結(jié)果一起求平均值，然后減法X%，即為控制點(diǎn)。X為變數(shù)，由廠家用定量方法校準(zhǔn)。

方法二：以空白加標(biāo)樣品來(lái)確定控制點(diǎn)。這種方法的關(guān)鍵是找到陰性樣品，如果沒(méi)有其它的定量方法找陰性樣品，可根據(jù)陰性對(duì)照平均值來(lái)找陰性樣品（陰性對(duì)照平均值±X%）。用此陰性樣品，按檢測(cè)水平和稀釋倍數(shù)，加kss標(biāo)準(zhǔn)品，用此空白加標(biāo)樣品，測(cè)定6次CPM值，求平均值，控制點(diǎn)＝平均值＊（1＋20%）。

測(cè)定實(shí)際樣品

前處理：不同的樣品具不同的前處理方法，一般尿樣、血清、血漿等只需用緩沖液稀釋即可，而組織樣品則需均質(zhì)、提取、孵育等過(guò)程，對(duì)于蜂蜜等一些樣品則要過(guò)柱?？偟膩?lái)說(shuō)，前處理要比ELISA更簡(jiǎn)便、快速。

按照操作說(shuō)明檢測(cè)結(jié)合試劑片加入試管；加入300微升水混均；加入處理過(guò)的樣品；加入標(biāo)記性yw，混合；孵育；離心，棄去上清液；加水混均；加閃爍液，混均；讀數(shù)。

三、實(shí)驗(yàn)室分析質(zhì)量控制

涉及儀器的校正、過(guò)程控制、標(biāo)準(zhǔn)物控制、環(huán)境、實(shí)驗(yàn)室管理（監(jiān)控所進(jìn)行的測(cè)試及記錄結(jié)果，以便發(fā)現(xiàn)發(fā)展趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)技術(shù)進(jìn)行結(jié)果評(píng)審）

1、快速篩選方法及定性方法

選擇性：檢出目的物質(zhì)的能力；

靈敏性：樣品中檢出這種yw真正陽(yáng)性結(jié)果的比率；

準(zhǔn)確性：所得值和真實(shí)值的一致性，用不確定度來(lái)衡量——重復(fù)多次測(cè)定值和真實(shí)值之差；

檢測(cè)限：分析方法能從樣品背景信號(hào)中檢測(cè)出待檢物質(zhì)的{zd1}濃度；

重復(fù)性：

2、定量方法的附加要求

回收率：

定量限：分析方法能對(duì)樣品中待檢物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)的{zd1}濃度，反映該方法在低濃度端分析結(jié)果的可靠性；

精密度：對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定，每次測(cè)定值和均值的接近程度，主要反映隨機(jī)誤差；

重復(fù)性：批內(nèi)重復(fù)、批間重復(fù)線(xiàn)形范圍：曲線(xiàn)的擬和

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